Membrane: MEMBRANE — Перевод на русский

— обзор

II Бимолекулярная липидная мембрана

Термин плазматическая мембрана происходит от немецкого Plasmamembran, слова, придуманного Карлом Вильгельмом Нэгели (1817–1891) для описания твердой пленки, которая образуется, когда белковый сок поврежденной клетки контактирует с водой. Физиолог Л.В. Хейльбрунн назвал это и подобные явления «реакцией поверхностного осаждения», как описано в его книге The Dynamics of Living Protoplasm (1956).«Протоплазма» — это старый термин для обозначения вещества внутри клеток, который широко использовался до того, как методы электронной микроскопии и дифференциального центрифугирования помогли выяснить подробные структуры и специфические функции отдельных клеточных органелл. Участие того, что мы знаем сегодня как клеточная мембрана, и биохимия образования поверхностной пленки в ответ на повреждение клетки впоследствии не были объяснены. Таким образом, первоначальное использование термина «плазматическая мембрана» имеет неясное отношение к его нынешнему значению.

Многие знания о структуре и функциях мембран получены из исследований красных кровяных телец, как показано на микрофотографии, сделанной с помощью сканирующего электронного микроскопа, на рис. 3.1. Эритроциты высоко дифференцированы и специализируются на транспортировке кислорода и углекислого газа в крови. Они состоят в основном из плазматической мембраны, окружающей концентрированный раствор гемоглобина, и лишены ядра, митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом, аппарата Гольджи и лизосом. Более 100 лет назад обширные исследования осмотического давления и проницаемости эритроцитов Гамбургером, растительных клеток де Фриза и многих живых клеток Овертоном предоставили доказательства того, что липоидная мембрана окружает клетки.Жирорастворимые вещества, которые являются липофильными и легко растворяются в липидах, легко проникают в клетки, тогда как водорастворимые вещества поступают в клетки медленнее, если вообще. Овертон обнаружил корреляцию между коэффициентом разделения нефть-вода и проницаемостью мембраны; тем не менее, ни в одном из этих ранних исследований мембрана не постулировалась как отдельная структурная единица для объяснения результатов (см. Jacobs, 1962).

РИСУНОК 3.1. Сканирующая электронная микрофотография эритроцитов человека. Двояковогнутые дискоидные ячейки имеют диаметр 8 мкм и 2. Толщина 4 мкм по краю и 1,0 мкм в центре.

В 1925 году Гортер и Грендель использовали ацетон для извлечения липидов из известного количества эритроцитов и, после испарения растворителя, измерили площадь, которую экстрагированные липиды занимали в виде мономолекулярной пленки на границе раздела воздух-вода, с помощью лотка Ленгмюра. По площади пленки экстрагированных липидов и площади поверхности эритроцитов, оцененной с помощью световой микроскопии, они пришли к выводу, что: «Очевидно, что все наши результаты хорошо согласуются с предположением о том, что хромоциты покрыты слоем. жирных веществ толщиной в две молекулы »(Гортер и Грендель, 1925, стр.443). Однако примерно 40 лет спустя было отмечено, что площадь поверхности эритроцитов на самом деле на 50% больше; Кроме того, экстракция ацетоном оставила около 30% липидов, оставшихся в призраках. К счастью, эти две ошибки имели тенденцию уравновешивать друг друга (Bar et al. , 1966), показывая, что в редких случаях в науке вы можете быть правы по неправильным причинам. Бимолекулярный липидный листок толщиной 75–100 Å, впервые предложенный Гортером и Гренделем в качестве модели клеточной мембраны (рис. 3.2), до сих пор составляет основу современных представлений о структуре клеточных мембран.Суть этой модели состоит в том, что фосфолипиды мембраны расположены в параллельных слоях, образуя два полуслоя, полярные головные группы которых обращены к водным внутриклеточным и внеклеточным растворам, а их неполярные цепи жирных кислот взаимодействуют латерально внутри гидрофобного ядра мембраны.

РИСУНОК 3.2. Модель бимолекулярной фосфолипидной мембраны, предложенная Гортером и Гренделем (1925).

Для чистых липидов ожидаемое поверхностное натяжение , измеренное в лотке Ленгмюра, составляет около 9 дин / см, но поверхностное натяжение морских яиц и других типов клеток примерно в 50–100 раз меньше всего лишь за 0.1–0,2 дин / см. Поверхностное натяжение можно представить как силу, необходимую для закрытия щели на поверхности мембраны. Даниелли и Харви обнаружили, что яичный белок может снизить поверхностное натяжение границы раздела масло-вода примерно до 0,6 дин / см, что привело Дэвсона и Дэниелли (1943) к постулированию наличия двух пленок белка, связанных с группами полярных головок с каждой стороны. бимолекулярного липидного листка, модель, которая стала известна как пауцимолекулярная мембрана Дэвсона – Даниелли (рис.3.3). Предположительно, белок функционировал, чтобы укрепить и стабилизировать тонкую липидную пленку. Paucimolecular означает, что эта модель включала всего несколько молекул: бимолекулярный липидный листок с прилипшими белковыми пленками на внутренней и внешней поверхностях.

РИСУНОК 3.3. Пауцимолекулярная модель структуры мембраны.

С помощью электрофизиологических методов было измерено электрическое сопротивление клеточных мембран, которое оказалось очень высоким, что также согласуется с предложением об изоляционной липидной мембране, окружающей клетки. В других исследованиях мембран было определено их двулучепреломление . Двулучепреломление — это оптическое свойство некоторых ориентированных материалов, которое можно определить, поместив образец между двумя скрещенными поляроидами на предметном столике микроскопа.Пленка Polaroid пропускает только свет, электрический вектор которого параллелен оси пленки Polaroid; две пленки Polaroid, скрещенные под прямым углом и поднятые к свету, кажутся черными. Но если кристалл или другое вещество, в котором сами молекулы ориентированы, поместить между скрещенными поляроидами, проходящий свет будет поляризован по кругу, и образец будет выглядеть ослепительно ярким. Образец, который кажется ярким при помещении между скрещенными поляроидами, называется двулучепреломляющим. Собственное двойное лучепреломление обусловлено ориентированной природой отдельных молекул, таких как нитчатые белки, тогда как формирует двойное лучепреломление связано с ориентированным расположением молекул в массиве, например, при параллельной упаковке актиновых и миозиновых нитей в мышцах. саркомеры. Когда мембраны эритроцитов просматривали с помощью поляризационного микроскопа, липиды вносили вклад в двойное лучепреломление, как и лежащий под ними цитоскелет, в соответствии с паучимолекулярной моделью структуры мембраны.

Электронные микрофотографии с высоким разрешением мембраны единицы также подтвердили паучимолекулярную модель Дэвсона – Даниелли. Термин элементарная мембрана относится к повсеместной триламинарной структуре толщиной 75–100 Å, видимой на электронных микрофотографиях тонких срезов клеток и органелл. Изображение выглядит как две темные линии, каждая толщиной около 25–30 ÅA, окружающие более светлую зону, и особенно хорошо разрешается в образцах, зафиксированных перманганатом калия. Электронно-микроскопический снимок тонкого среза плазматической мембраны эритроцитов человека показан на рис.3.4. Практически такая же триламинарная структура наблюдалась не только на поверхности эритроцитов, но также в мышечных клетках, нервных клетках, эпителиальных клетках, растительных клетках, бактериальных клетках и практически во всех исследованных органеллах мембранных клеток. В ситуациях, когда две клетки плотно прилегали друг к другу, две триламинарные структуры составляли двойную мембрану . В миелиновой оболочке, окружающей нервные клетки, была видна серия триламинарных структур в спиральном расположении, согласующемся с оболочкой нервных аксонов мембраной шванновских клеток, как показано на рис.3.5A. Поскольку подробные химические реакции перманганата калия с тканью полностью не изучены, оставалась некоторая неопределенность в отношении основы изображения, которое наблюдалось в шлифах. Однако универсальность единичной мембраны была принята как веское свидетельство в поддержку паучимолекулярной модели Дэвсона-Даниелли. Дальнейшие исследования многослойной миелиновой оболочки нервных аксонов с помощью дифракции рентгеновских лучей центрифугированных незафиксированных и неокрашенных мембран дали профили электронной плотности, которые также согласуются с паучимолекулярной моделью Davson-Danielli (Worthington and McIntosh, 1973).Как видно на рис. 3. 5B, электронная плотность низкая в гидрофобной сердцевине мембраны и высокая в полярных областях фосфатных групп. Более того, толщина мембраны, определенная на основе этих рассчитанных профилей электронной плотности неокрашенной миелиновой оболочки, количественно согласуется с толщиной мембраны в тонких срезах, фиксированных перманганатом калия — наблюдение, являющееся убедительным доказательством, подтверждающим предложение о бимолекулярном фосфолипиде. листочка как основа структуры клеточных мембран.Таким образом, доказательства для модели пауцимолекулярной мембраны состояли из исследований проницаемости, электрического сопротивления и микроскопических наблюдений двойного лучепреломления с помощью светового микроскопа, а также изображений с высоким разрешением как окрашенных, так и неокрашенных клеток с помощью электронного микроскопа. Эти убедительные аргументы были обобщены в классической монографии The Permeability of Natural Membranes , написанной Дэвсоном и Даниелли (1943), книге, которая сильно повлияла на последующее развитие клеточной и мембранной физиологии.

РИСУНОК 3.4. Электронная микрофотография тонкого среза единичной мембраны эритроцита.

РИСУНОК 3.5. (A) Миелиновая оболочка аксона спинного мозга (любезно предоставлена ​​доктором Седриком Рейном). (B) Профиль электронной плотности седалищного нерва лягушки.

Мембранные альтернативы в мирах без кислорода: создание азотосомы

Abstract

Двухслойная липидная мембрана, которая является основой жизни на Земле, нежизнеспособна вне биологии, основанной на жидкой воде. Этот факт побудил астрономов, которые ищут условия, подходящие для жизни, искать экзопланеты в «обитаемой зоне», узкой полосе, в которой может существовать жидкая вода. Однако могут ли клеточные мембраны быть созданы и функционировать при температурах намного ниже тех, при которых вода является жидкостью? Мы делаем шаг к ответу на этот вопрос, предлагая новый тип мембраны, состоящей из небольших органических соединений азота, способных образовываться и функционировать в жидком метане при криогенных температурах. Используя молекулярное моделирование, мы демонстрируем, что эти мембраны в криогенном растворителе обладают эластичностью, равной эластичности липидных бислоев в воде при комнатной температуре. В качестве доказательства концепции мы также демонстрируем, что стабильные криогенные мембраны могут возникать из соединений, наблюдаемых в атмосфере спутника Сатурна, Титана, известного наличием морей жидкого метана на его поверхности.

• Титан
• абиогенез
• экзобиология
• липосома
• физическая химия
• квантовая химия
• вычислительная химия
• молекулярная динамика

ВВЕДЕНИЕ

Исследования протобиологии и образования клеток на Земле в основном сосредоточены на нуклеиновых кислотах; действительно, обычно считается, что рибонуклеиновые кислоты были предшественниками земной жизни (гипотеза «мира РНК») (–1). Однако недавние исследования показали, что катализ РНК зависит от установления высоких локальных концентраций, а это означает, что компартментализация, вероятно, была такой же или более ранней фазой, чем РНК ( 2 ). Это подтверждает гипотезу «липидного мира», в которой липидные мембраны сыграли важную роль как очень ранний эволюционный шаг в создании жизни на Земле ( 3 ). Было обнаружено, что липидные бислои без дополнительных клеточных механизмов растут, делятся, способствуют реакциям полимеризации и даже синтезируют РНК из ферментов полимеразы ( 4 — 6 ).

Мембраны земных клеток состоят из бислоя фосфолипидов: поверхностно-активных веществ, состоящих из неполярных липидных цепей и насыщенных кислородом полярных головок. Полярные головки образуют поверхности, совместимые с водой, позволяя мембране разделять водный мир снаружи и водную жизнь внутри. Липидные хвосты фосфолипидов объединяются силами Ван-дер-Ваальса, таким образом стабилизируя мембрану. Везикула, состоящая из такой мембраны, называется липосомой.

Роль самоорганизующихся поверхностно-активных веществ в эволюционной биологии на Земле поднимает вопрос о том, могут ли неводные условия поддерживать любую аналогичную структуру.Экспериментальные исследования были выполнены для создания везикул в неполярных растворителях. Это включало рассмотрение неионных простых эфиров ( 7 ), сложных эфиров ( 8 ), поверхностно-активных веществ ( 9 ) и инвертированных фосфолипидов ( 10 ). Обратные фосфолипидные мембраны даже рассматривались как биологические возможности в жидком метане ( 7 — 16 ).

Жидкий метан представляет особый интерес, потому что это единственная жидкость, кроме воды, которая образует моря на поверхности планетарного тела в нашей солнечной системе.Это тело — спутник Сатурна, Титан ( 11 , 12 ). Неизвестно, может ли Титан поддерживать любую форму клеточной мембраны. Однако мы действительно наблюдаем, что на поверхности Титана происходит неизвестный процесс, который потребляет водород, ацетилен и этан, которые постоянно стекают из атмосферы, но не накапливаются ( 13 — 15 ). Это делает жидкий метан очень интересным растворителем для использования в качестве альтернативы клеточной мембране.

Однако фосфолипидные мембраны, которые настолько прочны и эластичны в воде, не работают так хорошо в жидком метане.Неполярные хвосты фосфолипидов, казалось бы, совместимы с неполярным жидким метаном, а полярные головы — друг с другом; Означает ли это, что мембрана, обратная той, которая образовалась в воде, могла существовать в метане? К сожалению нет; эта гипотеза фосфолипидов не учитывает тот факт, что хвосты фосфолипидов представляют собой длинноцепочечные углеводороды, которые будут жесткими при криогенных температурах. Кроме того, атомы фосфолипидного головного компонента, кислорода и фосфора, недоступны ни в какой форме в метановых морях Титана и, вероятно, ни в какой подобной среде жидкого метана.Следовательно, липосомы с обращенной фазой не являются жизнеспособным вариантом. Однако идея использования полярности для предотвращения растворения верна, если существуют какие-либо подходящие материалы.

В качестве доказательства концепции образования пузырьков в среде, богатой метаном, мы начали поиск полярных материалов, используя те, которые образуются естественным образом, когда ультрафиолетовый свет взаимодействует с атмосферой, содержащей метан и азот ( 12 ). Из спектроскопических наблюдений орбитального аппарата «Кассини» мы знаем наиболее распространенные полярные соединения в верхней части метано-азотной атмосферы Титана, как показано в таблице 1 [( 12 ), стр.167]. Ниже в атмосфере все эти виды конденсируются в аэрозоли, препятствуя дальнейшим наблюдениям с помощью Кассини. Лабораторные эксперименты по воспроизведению атмосферы метана и азота обычно дают смолистые остатки молекул, называемые толинами ( 17 ). Было обнаружено, что эти толины состоят из углеводородов, нитрилов и аминов ( 17 ). Поэтому мы также включили в наше исследование первичные нитрилы и амины длиной пропил-гексил, хотя содержание толинов относительно наблюдаемых Кассини видов остается неопределенным.

Учитывая проблемы экспериментальных исследований при криогенных температурах, мы приняли подход молекулярного моделирования для отбора наиболее многообещающих кандидатов для самосборки в структуру, напоминающую мембрану. Мы рассматривали только короткие лиганды, учитывая тот факт, что более длинные лиганды не дают никаких преимуществ при таких низких температурах. Все наши молекулы-кандидаты намного короче типичных фосфолипидов, которые включают углеродные цепи длиной от 15 до 20 атомов.Жидкий метан достаточно холоден, чтобы затвердеть практически любое вещество: четырехчленная углеродная цепь, например бутан, намного ниже точки замерзания, равной 133 К в жидком метане. При таких температурах может казаться почти невозможным формирование гибкой органической мембраны, не говоря уже о гибкости, подобной гибкости липидного бислоя. Однако низкая температура также позволяет небольшим молекулам агрегироваться иначе, чем при 300 К. Наша обычная интуиция должна быть приспособлена к более холодному миру.

Мы предположили, что мембраны жидкого метана будут полагаться на полярность азотсодержащих групп («азото»), чтобы удерживать их вместе, точно так же, как земные липосомы полагаются на неполярность алкильных групп. Поэтому мы назвали эти структуры «азотосомами». Сравнение липосом и предлагаемых структур азотосом показано на рис. 1.

( A ) Липосома в полярном растворителе.Полярные головы скреплены неполярными липидными хвостами. ( B ) Азотосома в неполярном растворителе. Неполярные хвосты подпирают головы, богатые полярным азотом.

Ключевые физические требования к мембране заключаются в том, чтобы она была гибкой и стабильной. Наиболее распространенной мерой гибкости клеточной мембраны является модуль расширения площади K _a (также известный как модуль расширения, растяжения или площади сжатия) ( 18 , 19 ). Модуль расширения площади мембран наземных клеток при комнатной температуре равен 0.От 24 до 0,50 Дж / м ² ( 18 , 19 ). Как мы покажем, некоторые из наших кандидатов на азотосомы лежат в этом диапазоне. Наиболее распространенной мерой стабильности является шкала энергии разложения или времени стабильности ( 20 ). В целом липидные бислои на Земле метастабильны ( 21 ). Мы покажем, что некоторые из наших кандидатов в азотосомы имеют высокую энергию разложения по сравнению с криогенной средой, что приводит к очень длительным временным масштабам стабильности.

Синтез азотосом для экспериментального исследования будет сложным проектом, сродни первому синтезу липосом и дополнительным трудностям в криогенных условиях.Однако молекулы, из которых состоят азотосомы, похожи на молекулы, которые обычно изучаются на Земле, что делает свойства азотосом доступными с помощью стандартного молекулярного моделирования. Молекулярная динамика (МД) десятилетиями использовалась для моделирования двухслойных мембран ( 20 , 22 — 24 ) и полимерных везикул (полимерсом) ( 25 ). Было обнаружено, что значения K, _и , рассчитанные методом MD, хорошо согласуются с экспериментами ( 18 ), что подтверждает использование нами метода для этих новых мембран.

Чтобы представить молекулярные силы в наших моделированиях, мы использовали Оптимизированные потенциалы для моделирования жидкостей (OPLS), которые являются хорошо известными и эффективными моделями для жидких углеводородов, малых органических молекул ( 26 , 27 ) и полимерсом ( 25 ). Мы подтвердили модели OPLS для наших молекул, подтвердив структуры, генерируемые OPLS, и парные энергии связи по сравнению с квантово-механическими расчетами ( 27 ), как описано в разделе «Материалы и методы».Только молекулы, которые OPLS точно моделировали с точки зрения длин связей, углов и энергий связи, были переданы для изучения в качестве кандидатов на азотосомы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ошибки в моделях OPLS для длин связей, валентных углов и двугранных (торсионных) углов для тестируемых нами соединений представлены в таблице 2. Расчеты для трех наиболее высоконенасыщенных соединений — цианоацетилена, цианоаллена и 2,4-пентадииннитрила. — не рассматривались далее, потому что их модели OPLS показали ошибки в средней длине облигаций более 0.04 Å, что мы сочли недопустимо большим. Поскольку эти виды крайне ненасыщены, вероятность того, что они останутся стабильными, когда они покидают верхние слои атмосферы, в любом случае меньше всего, поэтому их непригодность для моделирования OPLS вряд ли будет иметь здесь значение. Для остальных соединений средняя разница между структурами OPLS и ab initio для длин связи составляла 0,008 Å, 0,6 ° в углах и 0,3 ° в диэдрах (если они есть).

Средняя разница для каждого вида между его структурой OPLS и структурой, полученной с помощью ab initio оптимизации с моделью самосогласованного реакционного поля (SCRF) Онзагера для неявного растворителя.

Ab initio энергии связи были получены в вакууме и в неявном растворителе. Разница между этими энергиями составляла от 0,1 до 1,3 ккал / моль для всех исследуемых веществ, в среднем 0,6 ккал / моль. Разница между энергиями связи OPLS и ab initio составляла от 0,2 до 0,9 ккал / моль, в среднем составляя 0,6 ккал / моль. В общем, значения энергии связи, генерируемой OPLS для данного вида, находились между значениями ab initio с растворителем и без него, что поддерживает использование моделей OPLS.Можно ожидать, что энергии парной связи OPLS будут находиться между энергиями ab initio в вакууме и ab initio в растворителе, поскольку парные расчеты OPLS «подобны растворителям» из-за неполяризуемости модели OPLS. Это заставляет модель OPLS испытывать частичный эффект растворителя, даже когда присутствует только пара молекул. Особняком среди изученных нами молекул был HCN, энергия связи которого с OPLS была на 1,8 ккал / моль выше значения энергии связи, предсказанного ab initio представлением с неявным растворителем, что указывает на неточность модели OPLS для HCN.

Однако, как мы покажем позже, HCN не самособирается в азотосому из-за своего небольшого размера. Таким образом, его чрезмерная энергия связи не будет иметь значения, потому что в дальнейшем он не будет рассматриваться из-за отсутствия самосборки. Энергии связи, найденные тремя методами (расчет OPLS и ab initio для системы в вакууме и растворителе), представлены в таблице 3.

OPLS и расчеты ab initio дали аналогичные результаты.

Каждая азотосома начинает моделирование как сетку молекул, а затем самособирается в свою предпочтительную структуру.Виды, которые OPLS не мог точно представить, были исключены из рассмотрения, как и HCN, который не образовывал упорядоченный слой, и гексан, который образовывал твердое тело. Модули расширения площади оставшихся азотосом, а также простого бислоя гексана без функциональной головки показаны в таблице 4. Учитывая точность энергий связывания OPLS, мы ожидаем, что эти значения будут равны K _a и ∆ E с точностью до 20%.

Все наши азотосомы обладают гибкостью, аналогичной гибкости известных мембран наземных клеток: от 0,13 до 0,55 Дж / м ² для азотосом по сравнению с 0,24 до 0,50 Дж / м ² для наземных липосом. Что касается тепловых колебаний, азотосомы будут казаться более жесткими, чем земные липосомы, потому что тепловые колебания на Титане меньше, чем на Земле. Однако в отношении механического стресса криогенные азотосомы и липосомы при комнатной температуре будут реагировать на удивление одинаково.

Поучительно сравнение гексана и гексаннитрила. Простой гексан образует слой в восемь раз более жесткий, чем гексаннитрил. Кроме того, бислой гексана является хрупким, как показано на рис. 2. После небольшого растяжения кажется, что он трескается. Напротив, слой гексаннитрила равномерно растягивается на всем протяжении. Единственное различие между этими двумя соединениями состоит в том, что гексаннитрил имеет полярный азотный напор.

Наклон линейной посадки пропорционален модулю площади K _a .

Ключевое различие между чистым углеводородным слоем и азотосомой заключается в структуре, обусловленной полярным азотным напором. Мы полагаем, что именно эта структура позволяет криогенным азотосомам обладать гибкостью липидного бислоя при комнатной температуре.

Энергетические барьеры диссоциации для каждой азотосомы также приведены в таблице 4. Ацетонитрил, бутаннитрил, гексаннитрил, аминопропан и аминобутан имеют значения Δ E значительно ниже 8 ккал / моль, что указывает на нестабильные азотосомы.Азотосомы пропаннитрила, пентаннитрила, аминопентана и аминогексана имеют энергетический барьер, близкий к 8 ккал / моль. Их следует рассматривать в качестве возможных кандидатов, потому что их значения находятся в пределах 20% неопределенности, которая, как мы считаем, здесь уместна. Азотосомы акрилонитрила демонстрируют высокие барьеры разложения (17 ккал / моль), которые достаточны для обеспечения их стабильности в течение длительного времени.

Геометрия молекулы акрилонитрила, по-видимому, благоприятствует азотосомам и препятствует другим состояниям (рис.3). Это согласуется с тем фактом, что акрилонитрил, как экспериментально известно, имеет несколько неупорядоченную твердую фазу ( 28 ). Как и все азотосомы, изученные здесь, азотосомы акрилонитрила симметричны относительно плоскости мембраны, что означает, что, как и липидный бислой, они должны быть способны образовывать везикулы разных размеров.

( A ) Азотосома. Связанные атомы азота и водорода укрепляют структуру.( B ) Твердый. Соседние атомы азота создают неблагоприятное отталкивание. ( C ) Мицеллы. Соседние атомы азота делают это крайне неблагоприятным. ( D ) Азотосомная везикула диаметром 90 Å, размером с небольшую вирусную частицу.

Расчет свободных энергий, необходимых для определения K _a , также позволил нам получить полную свободную энергию разложения для каждой азотосомы. Эти значения показаны в Таблице 5. Все эти свободные энергии положительны, что указывает на то, что состояние азотосомы предпочтительнее растворенного состояния.Эти значения свободной энергии зависят от концентрации, потому что Δ G _{растворяется} всегда отрицательно при бесконечном разбавлении. Концентрация, создаваемая растворением одной молекулы азотосомы в каждой коробке, составляет около 0,1%, что выше, чем мы могли ожидать в морях Титана. Однако реальные концентрации в настоящее время неизвестны, поэтому они могут быть или не быть достаточно высокими, чтобы сделать азотосомы термодинамически стабильными. В Δ G нет тенденции в отношении количества атомов углерода в цепи.Δ G , по-видимому, определяется тем, как молекулы подходят друг к другу, а не каким-либо простым свойством самих молекул.

Чистая механическая работа, необходимая для удаления молекулы с мембраны, с погрешностью 20%. Эти значения зависят от концентрации.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы предполагаем, что в холодном мире без кислорода пузырьки, необходимые для компартментализации, ключевого требования для жизни, будут сильно отличаться от пузырьков, обнаруженных на Земле.Вместо длинноцепочечных неполярных молекул, образующих прототип земной мембраны в водном растворе, мы находим мембраны, которые образуются в жидком метане при криогенных температурах, благодаря притяжению между полярными головками короткоцепочечных молекул, богатых азотом. Мы назвали такую ​​мембрану азотосомой. Мы обнаружили, что гибкость таких мембран примерно такая же, как у мембран, образованных в водных растворах. Несмотря на огромную разницу в температурах между криогенными азотосомами и земными липосомами при комнатной температуре, которые делают почти любую молекулярную структуру жесткой, они демонстрируют удивительно и захватывающе похожие реакции на механическое воздействие.

На основании наших критериев термодинамической стабильности или, по крайней мере, метастабильности, азотосома кажется реализуемой криогенной мембраной. Исходя из всех известных молекулярных компонентов в атмосфере такого мира, Титана, мы смогли выбрать пару молекул-кандидатов, которые были способны проявлять свойства, которые, по-видимому, важны для образования пузырьков. Например, азотосома акрилонитрила имеет хорошую термодинамическую стабильность, высокий энергетический барьер для разложения и модуль расширения площади, аналогичный таковому у фосфолипидных клеточных мембран в богатых кислородом растворах.Акрилонитрил существует в атмосфере Титана в концентрации 10 частей на миллион и вероятно может образоваться на любом небесном теле с азотно-метановой атмосферой.

Наличие молекул, способных образовывать клеточные мембраны, само по себе не доказывает, что жизнь возможна. Тем не менее, он направляет наши поиски на экзотические метаболические и репродуктивные химические процессы, которые были бы аналогичным образом совместимы в криогенных условиях. По мере того, как наше понимание условий, которые могут способствовать развитию внеземной жизни, расширяется, увеличивается и наша вероятность найти ее, возможно, в зоне обитания жидкого метана.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первым свойством азотосом, которое мы исследовали, была их гибкость, измеренная по модулю расширения площади K _a . Одной из процедур, которая использовалась для расчета этого свойства, является моделирование спонтанных колебаний площади мембраны в течение длительного прогона МД ( 18 ). Однако этот метод основан на случайной выборке редких событий и, следовательно, имеет проблемы с точностью, завышая оценку K _a в ≥2 раз ( 18 ).Вместо этого мы сделали мембрану заданным отступом и рассчитали модуль расширения площади, исходя из сопротивления растяжению ( 18 ). Это напрямую сопоставимо с методом наноиндентирования, который используется для экспериментального определения K _a , и сравнение таких моделей и экспериментов с наземными липосомами показало, что они дают эквивалентные результаты ( 18 ).

Вторым критерием, который мы использовали для оценки азотосом, была их стабильность.Одна процедура, которая использовалась для изучения стабильности липосом, заключается в моделировании мембраны в течение длительного периода МД и наблюдении за ее диссоциацией спонтанно ( 20 ). К сожалению, ожидание диссоциации эффективно только для самых слабых мембран, поскольку МД обычно охватывает только наносекунды моделируемого времени. Лучшая процедура — найти временной масштаб диссоциации по энергии активации ( 29 ). По закону Аррениуса скорость процесса с энергией активации Δ E пропорциональна exp (−Δ E / k _B T ), где k _B — постоянная Больцмана. T — абсолютная температура ( 29 ).Если известен временной масштаб процесса без энергетического барьера, t ₀ , то временной масштаб процесса с барьером определяется как t = t ₀ exp (Δ E / к _B T ).

Зависимость шкалы времени от Δ E является экспоненциальной, поэтому неопределенность шкалы времени будет больше, чем лежащая в основе неопределенность энергетического барьера. К счастью, нам нужен только порядок величины шкалы времени.Для перемещения молекулы на 1 Å при 94 К без энергетического барьера требуется порядка т ₀ = 1 пс. Если, например, требуется энергия активации 8 ккал / моль, это дает масштаб времени 1 пс × exp (8 ккал / моль / k _B T ) = 235000 с (три земных дня). В отсутствие ошибки модели этот временной масштаб является достаточно длинным, чтобы можно было предположить, что азотосома достаточно стабильна, если ее энергетический барьер разложения превышает 8 ккал / моль.С погрешностью 20%, соответствующей погрешности между OPLS и ab initio энергиями связывания компонентов азотосом, более консервативным ограничением будет использование барьера в 10 ккал / моль, что соответствует времени разложения более 100 земных лет. .

Проверка силового поля OPLS

Мы подтвердили точность модели OPLS для наших молекул с помощью квантово-механических расчетов. Мы использовали программу квантовой механики Gaussian 09 с алгоритмом оптимизации Берни ( 30 ), используя уровень теории M062X / aug-cc-pVDZ и неявный углеводородный растворитель ( 31 ).Чтобы вычислить энергии связи, мы сравнили энергию оптимизированной свободно плавающей молекулы с энергией оптимизированной пары молекул. Для квантовой энергии связи мы исправили ошибку суперпозиции базисного набора по мере необходимости ( 32 ). Мы подтвердили структуры OPLS и парные энергии связи каждой из изученных здесь молекул в сравнении с этими квантово-механическими расчетами, и мы исключили любые модели OPLS, которые имели ошибки в расстояниях связи более 0,04 Å, в валентных углах (1 °), в двугранных углов (2 °) и энергий связи (1 ккал / моль).Двугранные, которые являются свободными роторами (например, вращение вокруг связи алканов C-C), не были включены в средние ошибки, поскольку их углы не вносят значительного вклада в энергию. Эти данные перечислены в результатах. Мы выполнили эти тесты, используя ab initio вычисления с вычислительно требовательной, но особенно точной теоретической базой M062X / aug-cc-pVDZ ( 33 ). Этот «миннесотский функционал», как известно, дает точные парные энергии связи для ван-дер-ваальсовых и полярных систем ( 34 ).

После подтверждения достоверности структур, созданных OPLS, с помощью моделирования ab initio, аналогичным образом были подтверждены и энергии связи. Для сравнения были созданы два набора энергий связи, генерируемых ab initio, один в вакууме и один в неявном растворителе. Энергии на основе растворителей ближе к экспериментальным условиям, тогда как энергии в вакууме использовались, по существу, как границы погрешности. Модели OPLS с ошибками энергии связи в растворителе более 1 ккал / моль были исключены.

Методика MD для гибкости мембраны

Чтобы найти гибкость и энергетические барьеры наших кандидатов в азотосомы, нам необходимо вычислить все возможные пути, по которым молекула может покинуть свою азотосому, а затем просуммировать соответствующие свойства этих маршрутов в соответствии с вероятностью их появления. Свойства, которые мы выбрали в качестве релевантных здесь, — это потенциальная энергия и сила, действующая на тестовую молекулу в направлении мембраны. Чтобы подготовить все эти возможные маршруты, мы начали с репрезентативного участка мембраны, сетки молекул размером 6 × 6 x — y для каждого вида-кандидата.

Затем этот кусок мембраны периодически расширяли, чтобы имитировать двумерную мембрану произвольной длины. Окружающее пространство было заполнено растворителем метаном. Краевые молекулы (те, для которых x = 0 или y = 0) удерживались фиксированными в направлении z , чтобы мембрана оставалась на месте. Мембране давали возможность уравновеситься, чтобы получить желаемую структуру, как показано на рис. 4.

( A ) Начальная сетка. ( B ) Аминопентан (аморфный). ( C ) Пентаннитрил (гексагональный). ( D ) Акрилонитрил (плотноупакованный гексагональный).

Затем тестовая молекула (в местоположении x , y = 3,3) постепенно удалялась в направлении z . При каждом приращении тестовой молекуле позволяли свободно перемещаться в направлениях [ x , y ]. В направлении z он был слабо ограничен гармоническим потенциалом, что позволяло ему отбирать близлежащие местоположения z , но не покидать окрестности.Эта процедура, известная как «зонтичная выборка», позволяет производить выборку из всех возможных конфигураций, а также обеспечивает оценку того, была ли выборка адекватной — мы можем просто проверить, достаточно ли у нас выборок из каждого небольшого приращения в направлении z . Схема этого процесса представлена ​​на рис. 5.

Тестовая молекула постепенно удаляется из мембраны в направлении z .

Эта процедура необходима из-за высоких барьеров азотосом к разложению. Если бы барьеры для разложения были низкими, система, естественно, произвела бы выборку разложенных состояний в течение смоделированного времени. Зонтичная выборка вынуждает моделирование достичь этих состояний, даже если для их возникновения потребуется очень много времени из-за собственных флуктуаций.

На каждом из миллионов шагов МД оценивалась функция потенциальной энергии и вычислялась сила, необходимая для удержания тестовой молекулы от мембраны.Это дало профили силы и потенциальной энергии в зависимости от расстояния от мембраны, которые приводятся отдельно в дополнительных материалах. Профили силы были интегрированы по расстоянию, чтобы получить профили свободной энергии, как показано на рис. 6. Изменение площади было рассчитано путем измерения отклонения атома азота с выемкой в ​​центре листа и определения площади образованной прямоугольной пирамиды. между ним и удерживаемым атомом азота по углам листа.Эта процедура оказалась очень устойчивой к изменениям общего размера листа. Отклонение зазубренного атома измерялось относительно равновесного состояния мембраны, то есть относительно точки минимума свободной энергии.

Наклон аппроксимирующей линии пропорционален модулю площади K _a .

Потенциальный энергетический барьер для каждой азотосомы был рассчитан путем обнаружения наибольшего единичного непрерывного увеличения потенциальной энергии во время разложения каждой азотосомы.Концепция определяющего скорость энергетического барьера в стиле Аррениуса основана на непрерывности барьера. Если существует устойчивое промежуточное состояние, при котором система может повторно уравновеситься, то это не один барьер, а два меньших барьера с резким увеличением предполагаемой скорости реакции. Поскольку мы использовали зонтичную выборку с ее детальным обзором энергетических профилей, мы смогли разделить их на очень мелкие участки (0,05 Å) и убедиться, что внутри наших барьеров нет промежуточных состояний.Пример барьера (акрилонитрил) показан на рис. 7.

Самый большой мгновенный энергетический барьер — это энергия активации разложения азотосомы.

Несколько мелких срезов 0,05 Å, почти все в начале и конце, где не могло произойти перекрытие зонтичного отбора проб, содержали менее 500 проб. Мы удалили эти участки для рассмотрения как барьеры, потому что (500 образцов) × (2 фс на образец) меньше, чем временной масштаб нашего уравновешивания NPT (1000 фс).В результате наши расчеты энергетического барьера становятся более консервативными, поскольку частота дискретизации участка обратно пропорциональна его энергии.

Все прогоны МД были выполнены с использованием крупномасштабного атомно-молекулярного массивно-параллельного симулятора (LAMMPS; распространение март 2014 г.) ( 35 ). Стандартные параметры OPLS использовались без изменений из наборов данных Jorgensen 2008 ( 36 ). Были соблюдены типичные передовые методы моделирования мембран с помощью МД. Например, ансамбль постоянной температуры и постоянного давления (NPT) был применен с использованием термостата Носа-Гувера и баростата, причем баростат был анизотропным ( 37 ).Анизотропный баростат позволяет мембране свободно изменять или терять свою структуру, повышая реалистичность моделирования ( 20 ). Температура была установлена ​​на 94 К, а давление на 1,45 атм, аналогично условиям на поверхности Титана ( 17 ). Использовалось интегрирование Верле с шагом по времени 2 фс ( 37 ). Алгоритм «частица-частица-сетка» использовался для добавления дальнодействующих кулоновских взаимодействий, которые важны при моделировании мембран ( 38 ).Короткодействующие силы, кулоновские взаимодействия и силы Леннарда-Джонса вычислялись попарно с радиусом отсечки 8 Å ( 38 ). Каждая мембрана была инициализирована как плоская плоскость x — y с периодическими граничными условиями в x , y и z , как показано на рис. 3. Начальный размер ячейки моделирования составлял 21 × 21 × 42 Å. Положение тестируемой молекулы изменяли с шагом 0,2 Å, начиная на 2 Å ниже ее начального положения в мембране и заканчивая на 10 Å выше, что дает 60 имитаций для каждого тестируемого вида.Затем сбор данных выполнялся в течение 1 нс на каждом приращении. Направление z на каждую молекулу оказывалось на ее концевой атом азота или, в неполярной молекуле, на ее концевой атом углерода. Это позволяло каждой молекуле вращаться, если она испытывала асимметричную силу, давая ей доступ к максимальному количеству степеней свободы. Ограничения на краевые молекулы были абсолютными ( z сил были установлены равными нулю), тогда как ограничение на тестовую молекулу было наложено как гармоническая сила с жесткостью упругости 10 ккал / моль-Å.Это умеренное ограничение позволило исследуемой молекуле покрыть диапазон 0,2 Å и перекрыться с диапазонами других моделей, обеспечивая непрерывный анализ свойств системы.

Исправление (25 марта 2015 г.): Обновлен раздел благодарностей.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечное использование не преследует коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно процитировано.

ССЫЛКИ И ПРИМЕЧАНИЯ

1. ↵
2. ↵
3. ↵
4. ↵
6. ↵
7. ↵
8. ↵
9. ↵
10. ↵
11. ↵
12. ↵

    I. Müller-Wriodar E. Lellouch, TE Cravens, Titan: Interior, Surface, Atmosphere, and Space Environment (Cambridge University Press, Кембридж, Великобритания, 2014), т. 14.

13. ↵
15. ↵
16. ↵
17. ↵
18. ↵
19. ↵
20. ↵
21. ↵
22. ↵
24. ↵
25. ↵
26. ↵
27. ↵
28. ↵
29. ↵
30. ↵
31. ↵
32. ↵
33. ↵
34. ↵
35. ↵

    W.Йоргенсен, Всеатомные параметры OPLS для органических молекул, ионов, пептидов и нуклеиновых кислот (Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут, 2009).

36. ↵
37. ↵

• Авторские права © 2015, Авторы

Первый взгляд на мембрану живой клетки

Рассеяние нейтронов — ценный метод изучения клеточных мембран, но сигналы от других компонентов клетки, таких как белки, РНК, ДНК и углеводы, могут попасть внутрь. путь (слева).Команда из Окриджской национальной лаборатории сделала эти другие компоненты практически невидимыми для нейтронов, объединив определенные уровни тяжелого водорода (дейтерия) с нормальным водородом внутри клетки (справа).

The Science

Клеточная мембрана, тонкий бислой липидных молекул со встроенными белками, защищает клетку от внешней среды и контролирует перемещение веществ в клетку и из нее. Однако многое в этом тонком бислое липидных молекул остается загадкой, несмотря на обширные исследования.Это было связано с трудностями при просмотре мембраны живой клетки; предыдущие методы, используемые для исследования структуры мембраны, такие как рентгеновские лучи и электронные лучи, повреждали мембраны. Впервые с помощью холодных нейтронов исследователи непосредственно исследовали мембрану живой клетки в наномасштабе.

The Impact

Используя изотопы для создания внутреннего контраста в живых клетках, ученые определили структуру и толщину мембраны бактерии Bacillus subtilis .Команда также подтвердила существование предполагаемых длинных липидных рафтов. Считается, что эти плотно упакованные свободно плавающие мембранные липиды и белки имеют жизненно важное значение для передачи сигналов клетками. Считается, что плоты также способствуют перемещению основных биомолекул в клетку и из нее, а также выполняют другие функции. Разработанные методы могут оказаться полезными при производстве сырья для биомассы и биотоплива, где бактерии играют важную роль.

Резюме

Изучение живой клеточной мембраны до сих пор оставалось нерешенной задачей из-за динамичной, химически разнообразной и хрупкой природы живых клеток.Нейтроны были слишком малы, чтобы их можно было увидеть в традиционный оптический микроскоп, и они стали решением для изучения живого липидного бислоя на наноуровне без повреждения клетки. Нейтроны можно использовать в качестве зонда для характеристики биологических материалов, потому что пучок нейтронов, рассеянный биологическим образцом, создает узор, который зависит от изотопного состава материала и отражает его структурное расположение. Дейтерий — это изотоп водорода, который находится в большом количестве в биологическом веществе.Он содержит нейтрон и протон, в отличие от водорода, который содержит единственный протон, но не содержит нейтрона. Эта, казалось бы, небольшая разница делает замену водорода дейтерием идеальным подходом к изучению мембран и других наноразмерных биологических систем. Клетки воспринимают небольшую разницу между водородом и его изотопом, дейтерием, в то время как изотопы проявляются совсем по-другому при использовании метода рассеяния нейтронов. Группа исследователей из Окриджской национальной лаборатории (ORNL) ввела достаточное количество дейтерия в мембрану бактерии B.subtilis , чтобы отличить его от других компонентов клетки. Кроме того, команда настроила конкретные пропорции дейтерия и водорода, введя в клетку два типа жирных кислот (молекулы, составляющие мембранные липиды) с уникальным соотношением изотопов. Клетка включила в свою мембрану специфическую смесь меченых изотопами жирных кислот, и наблюдали неоднородное распределение липидов, что подтверждает гипотезу липидного растра. Эти эксперименты отвечают на некоторые из самых давних вопросов биологии, согласующиеся с U.S. Миссия отдела науки Министерства энергетики по обеспечению фундаментальных научных исследований для решения некоторых из самых насущных проблем нашего времени.

Контакт

PM Контакт
Эми Суэйн, Ph.D.
Менеджер программы
Отдел биологических систем
Отдел биологических и экологических исследований
Отдел науки
Министерство энергетики США
[email protected]

Контактное лицо для физических лиц
Джон Катсарас
katsarasj @ ornl.gov

Финансирование

Это исследование спонсировалось Программой исследований и разработок под руководством лаборатории (грант 6988) Национальной лаборатории Ок-Ридж (ORNL), управляемой UT-Battelle, LLC, для Министерства энергетики США (DOE) по контракту. DE-AC05-00OR22725. Поддержка J.K. был предоставлен Департаментом науки, фундаментальных энергетических наук, отделом научных пользователей Министерства энергетики США и Министерством энергетики США Департаментом науки, биологических и экологических исследований Министерства энергетики (грант ERKP-851).В этом исследовании использовались ресурсы центра Oak Ridge Leadership Computing Facility в ORNL при поддержке Управления науки Министерства энергетики США, Управления перспективных научных исследований в области вычислительной техники, отдела технических средств. Малоугловое рассеяние нейтронов было выполнено в ORNL с использованием прибора Bio-SANS на реакторе с изотопами с высоким потоком при поддержке Управления науки Министерства энергетики, Управления биологических и экологических исследований, Отдел биологических систем науки через Центр структурной молекулярной биологии ORNL. , а также дифрактометр для малоуглового рассеяния нейтронов с расширенным Q-диапазоном в источнике нейтронов расщепления, поддерживаемый Министерством энергетики Министерства энергетики США, Отделение научных объектов для пользователей (грант ERKP-SNX).

Публикации

Дж. Д. Никелс, С. Чаттерджи, К. Б. Стэнли, С. Цянь, X. Ченг, Д.А.А. Майлз, Р.Ф. Standaert, J.G. Элкинс и Дж. Кацарас, «Структура биологических мембран in vivo и доказательства липидных доменов». PLoS Biology 5, 15 (2017). [DOI: 10.1371 / journal.pbio.2002214]

Ссылки по теме

Пресс-релиз Национальной лаборатории Оук-Ридж: Нейтроны дают первый наноразмерный взгляд на мембрану живых клеток

Основные категории

Программа: ASCR, BER, BSSD

Исполнитель / объект: Лаборатория Министерства энергетики, объекты пользователя SC, объекты пользователя ASCR, OLCF, объекты пользователя BES, HFIR, SNS

Что такое мембраны? | Протокол

5.1: Что такое мембраны?

Ключевой характеристикой жизни является способность отделять внешнюю среду от внутреннего пространства. Для этого в клетках появились полупроницаемые мембраны, которые регулируют прохождение биологических молекул. Кроме того, клеточная мембрана определяет форму клетки и взаимодействие с внешней средой. Мембраны эукариотических клеток также служат для разделения внутреннего пространства на органеллы, включая эндомембранные структуры ядра, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи.

Мембраны в основном состоят из фосфолипидов, состоящих из гидрофильных головок и двух гидрофобных хвостов. Эти фосфолипиды самоорганизуются в бислои, хвосты которых ориентированы к центру мембраны, а головки расположены наружу. Такое расположение позволяет полярным молекулам взаимодействовать с головками фосфолипидов как внутри, так и снаружи мембраны, но предотвращает их перемещение через гидрофобное ядро ​​мембраны.

Белки и углеводы способствуют уникальным свойствам клеточной мембраны.Интегральные белки встроены в мембрану, а периферические белки прикреплены либо к внутренней, либо к внешней поверхности мембраны. Трансмембранные белки — это интегральные белки, покрывающие всю клеточную мембрану. Белки трансмембранного рецептора важны для передачи сообщений извне внутрь клетки. При связывании с внеклеточной сигнальной молекулой трансмембранные рецепторы претерпевают конформационные изменения, которые служат внутриклеточным сигналом. Другие белки, такие как ионные каналы, служат для регулирования прохождения больших или полярных молекул через ядро ​​гидрофобной мембраны.

Углеводы связаны либо с липидами, либо с белками на внешней поверхности клеточной мембраны. Уникальные структуры гликопротеинов и гликолипидов, присутствующие на внешней поверхности клетки, позволяют клеткам распознаваться. Иммунные клетки человека способны отличать себя от чужого, распознавая углеводные модификации на поверхности клеток. Вместе белки, углеводы и липиды, присутствующие на мембране, создают функциональную и гибкую границу для клеток.

Рекомендуемая литература

Сыч, Тарас, Ив Мели и Винфрид Ремер.«Самосборка липидов и реорганизация плазматической мембраны, вызванная лектином». Философские труды Королевского общества B: Биологические науки 373, нет. 1747 (2018): 20170117. [Источник]

Тарбелл, Джон М. и Л. М. Кансел. «Гликокаликс и его значение в медицине человека». Журнал внутренней медицины 280, вып. 1 (2016): 97-113. [Источник]

Первые свидетельства существования молекул клеточных мембран в космосе